Cdna文库获取目的基因优点（如何从cdna文库获取目的基因）

见贤思齐

基因工程 基因工程的概念 ： 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 基因工程的原理：基因重组 1.1DNA重组技术的基本工具 1.分子手术刀——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）方式：当限制酶在它识别序列的中心轴线（图中虚线）两侧将DNA的两条链分别切开时，产生黏性末端，当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生平末端。 平末端 （4）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端有两种形式：黏性末端和平末端。 2.分子缝合针——DNA连接酶 两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 3.分子运输车——基因进入受体细胞的载体 （1）常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （2）载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因（如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因），供重组DNA的鉴定和选择。 （3）其它载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒 1.2基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 一：目的基因的获取 1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。 2.从基因文库中获取目的基因 基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 基因组文库：含有某种生物全部基因的基因文库称为基因组文库。 部分基因文库：含有一种生物的一部分基因的基因文库称为部分基因文库，如cDNA文库。 获取目的基因需要的信息：基因的核苷酸序列；基因的功能；基因在染色体的位置；基因的转录产物mRNA；以及基因表达产物蛋白质。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 （2）目的：获取大量的目的基因 （3）原理：DNA双链复制 （4）过程：第一步：加热至90～95℃，DNA解链为单链； 第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合； 第三步：加热至70～75℃，Taq酶从引物起始进行互补链的合成。 （5）特点：指数(2n)形式扩增 二、基因表达载体的构建(核心) 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子： 是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，它能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子： 是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端，是转录在需要的地方停下来。 （3）标记基因的作用： 是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。如抗生素基因。 三、将目的基因导入受体细胞 1.转化的概念： 是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞： 采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。 将目的基因导入动物细胞： 最常用的方法是显微注射技术。方法的受体细胞多是受精卵。 将目的基因导入微生物细胞： 最常用的原核细胞是 大肠杆菌 ，其转化方法是：先用 Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞 ，再将 重组表达载体DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 四、目的基因的检测和表达 1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交(DNA-DNA)技术。 2.其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用分子杂交(DNA-RNA)技术。 3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。 4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如生物抗虫或抗病的鉴定等。 1.3基因工程的应用 1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。 2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。 3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。 4.基因诊断：又称为DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。 1.4蛋白质工程的概念 1、基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质 2、概念：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 A 转录 B 翻译 3、蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→ 设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因） 注意：目的基因只能用人工合成的方法